Vol. 2 – Núm. 2
Julio – Diciembre - 2019
Crecimiento poblacional de la bacteria rhizobium al asimilar diferentes fuentes de carbono
Population growth of rhizobium bacteria as well as different carbon sources
Crescimento populacional das bactérias rhizobium pela assimilação de diferentes fontes de carbono
Johanna Domenica Chicaiza Leon1
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
Heidi Nicole Garcia Panjon2
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
Katherine Ninoshca Giler Velez3
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
Milton Temistocles Andrade Salazar4
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
Recibido: 10/06/2019
Aceptado: 25/07/2019
Publicado: 24/08/2019
Las bacterias del género Rhizobium son un grupo de bacterias simbiontes que permiten que las plantas empleen el nitrógeno atmosférico, son capaces de establecer una relación de simbiosis con algunas especies de leguminosas como la soja y el fréjol, estas bacterias se alojan en las raíces formando nódulos,y se sintetizan el grupo hemo de dicha molécula. En este estudio se buscó determinar el crecimiento de la bacteria cuando es expuesta a diferentes fuentes de carbono como glucosa, fructuosa y almidón; las bacterias se obtuvieron a partir de nódulos del fréjol y para su aislamiento se empleó un medio selectivo ELMA-RC, luego se evaluó su crecimiento mediante espectrofotometría y se comprobó la existencia de las bacterias mediante pruebas bioquímicas donde se determinó que eran bacterias Gram negativas y respondieron según lo esperado a las pruebas bioquímicas. Finalmente se encontró diferencias significativas en el crecimiento bacteriano siendo, glucosa el tratamiento con mayor crecimiento bacteriano, debido a que el género Rhizobium tiene una alta tolerancia al consumo de glucosa gracias a que son quimioorganográficas.
Palabras claves: Rhizobium, fréjol, glucosa, fructuosa, almidón, espectrofotometría
Abstract
Rhizobium bacteria are a group of symbioting bacteria that allow plants to use atmospheric nitrogen, these are able to establish a symbiosis relationship with some species of legumes such as soya and beans, these bacteria are lodged in the roots forming nodules, they synthesize the heme group of that molecule, and the plant synthesizes the apoprotein forming a new molecule that the legume can use in its metabolism. This study sought to determine the growth of the bacteria when exposed to different sources of carbon, glucose, fruity and starch, the bacteria were obtained from nodules of the bean and for their isolation an ELMARC, then its growth was evaluated using spectrophotometry and the existence of the bacteria was verified by biochemical tests where it was obtained that were Gram negative bacteria and responded as expected to biochemical tests finally it was concluded that at least for a treatment the growth of bacteria turned out different since the batteries of the genus Rhizobium have a high tolerance to glucose consumption this thanks to being chemoorganographicissues.
Keywords: Rhizobium, beans, glucose, fructose, starch, spectrophotometry
Resumo
As bactérias do gênero Rhizobium são um grupo de bactérias simbióticas que permitem plantas usam nitrogênio atmosférico, eles são capazes de estabelecer uma relação de simbiose com algumas espécies de leguminosas, como soja e feijão, essas bacterias eles se alojam nas raízes formando nódulos, eles sintetizam o grupo heme da dita molécula, e pela planta a apoproteína é sintetizada formando uma nova molécula que leguminosa pode usar no seu metabolismo. Neste estudo, procuramos determinar a crescimento da bactéria quando exposta a diferentes fontes de carbono, glicose, frutose e amido, as bactérias foram obtidas a partir de nódulos do feijão e por sua isolamento foi utilizado meio seletivo ELMA-RC, então seu crescimento foi avaliado por meio de espectrofotometria e a existência da bactéria foi verificada por meio de testes bioquímicos onde foi obtido que eles eram bactérias Gram-negativas e responderam como esperado para testes bioquímicos foi finalmente concluído que pelo menos para um tratamento o crescimento das bactérias foi diferente desde as bactérias do gênero Rhizobium eles têm uma alta tolerância ao consumo de glicose, graças ao fato de serem quimiororganográficos.
Palavras-chave: Rhizobium, feijão, glicose, frutose, amido, espectrofotometría.
Introducción
Las Rhizobium son un género de bacterias pertenecientes a la familia de las Rhizobiaceae, a las cuales ayudan a fijar el nitrógeno en las plantas para que estas tengan un desarrollo óptimo, lo que permite que los cultivos se mantengan en buen estado de salud (Alarcón, 2004). Las Rhizobium son organismos que habitan en la rizósfera de las plantas y generalmente se alimentan de restos de organismo en descomposición, a su vez, estos microorganismos son bacterias Gram negativas del suelo en las que su importancia se basa en la acción de nodulación en las raíces de las plantas que absorben el nitrógeno del medio exterior, esto gracias a que contienen un plásmido que codifica la información permitiendo causar la nodulación.
Las bacterias Rhizobium en suelos agrícolas presentan ciertos beneficios, siendo una de estos un buen desarrollo de plantas en suelos que carecen de nitrógeno; situación que se realiza gracias a la simbiosis que mantienen mutuamente, lo que permite que exista la fijación biológica que es realizada por la bacteria; las plantas por su parte se encargan de brindar el ambiente que estas necesitan para sobrevivir (Ameluz, 2014).
Entre los beneficios que proporciona Rhizobium se puede mencionar lo siguiente: plantas libres de enfermedades, mayor producción agrícola, menor gasto en producción por el bajo consumo de fertilizantes y calidad medio ambiental. En cuanto a su cultivo, para un proceso correcto de siembra de Rhizobium es importante seleccionar nódulos que presenten mejores características, por lo general son aquellos que presentan apariencia más robusta debido a que es más probable que se encuentre presente la bacteria. Considerando medidas asépticas se desprenden los nódulos de las raíces para su descontaminación y posteriormente establecer la siembra, la cual necesita de un tiempo de incubación de 48 a 72 horas (Ameluz, 2014).
Con respecto a la verificación del correcto crecimiento de las bacterias, existen varios métodos por los cuales se las puede definir e identificar, uno de ellos es la prueba catalasa, que consiste en agregar agua oxigenada sobre una pequeña muestra la cual comenzará a reaccionar positivamente dando a conocer la presencia de la bacteria, debido a que Rhizobium posee la enzima catalasa.
Otra forma de identificar a las bacterias es aplicando pruebas bioquímicas como lo son la oxidasa, ureasa, fuentes de carbono; que reaccionarán positivamente ya que todas estas composiciones se encuentran formando parte de la estructura de las bacterias Gram negativas Rhizobium.
Materiales y métodos
La recolección de las muestras se realizó en la provincia de Santo Domingo de los Tsàchilas en el km 35, las muestras fueron recolectadas del maní forrajero a estas se les retiro completamente la raíz del suelo con el propósito de obtener sus nódulos evitando dañarlas. Luego fueron empaquetadas en fundas herméticas y trasportadas al laboratorio de la UFA-ESPE ubicado en la vía Quevedo 35 Km.
Preparación del Agar Manitol Extracto de Levadura-Rojo de Congo (ELMA-RC)
Se siguió la composición que se muestra en la tabla 1. Para preparar tres cultivos ELMA-RC, cada uno con 30 ml, se vertió la cantidad establecida mientras se agitaba constantemente con la ayuda de una plancha magnética. Se procedió a esterilizar en un autoclave a 121 °C durante 25 min para finalmente dispensarlo en las cajas de Petri.
Tabla 1:
Composición del medio de cultivo Agar Manitol Extracto de Levadura-Rojo de Congo
|
Compuesto |
Cantidad establecida por litro de medio |
|
KH2PO4 |
0.5 g |
|
MgSO4•7H2O |
0.2 g |
|
NaCl |
0.1 g |
|
Manitol salt Agar |
111 g |
Elaborado por: Los autores
Incubación de Rhizobium en medios con diferentes carbohidratos
Las bacterias se cultivaron en los tubos durante una semana a 30 °C, una vez obtenidas fueron trasportadas a otro cultivo para obtener una muestra pura, el aumento de la concentración se empleó espectrofotometría.
Pruebas bioquímicas
La comprobación de que las bacterias estudiadas son las planteadas se realizó utilizando las reacciones bioquímicas denominadas catalasa, ureasa, carbohidratos, amilasa y potasa.
a) Catalasa
Se le añadió unas gotas de peróxido de sodio al 3 % a la muestra ubicada sobre un portaobjetos, la muestra se obtuvo del cultivo previamente incubado durante 48 horas. La observación de burbujeo indica prueba positiva.
b) Ureasa
Se realizó utilizando el caldo de urea de Stuart que fue preparado previamente, su composición necesita 0,1 g de extracto de levadura, 9.1 g fosfato monopotásico, 9.5 g fosfato disódico, 20 g urea, 0.01 g rojo fenol. Donde por cada 3,87g del medio deshidratado se agrega 100 ml de agua. Para disolver se calentó el agua sin hervir, luego se esterilizo empleando la autoclave y se añadio 10 ml de la solución en cada tubo. Las bacterias se cultivaron en este medio durante aproximadamente 24 horas. La prueba es positiva al producirse un color rojizo.
c) Carbohidratos con rojo de fenol
Los tubos empleados para esta prueba fueron los utilizados para el conteo bacteriológico mediante espectrofotometría después de terminada la semana de observación. A cada tubo que contenía el caldo nutritivo con un carbohidrato se le vertió unas 5 gotas de rojo fenol. La prueba es positiva si el pH cambia y por tanto el color de rojo a amarillo (Chain, 2011).
d) Amilasa
Se adicionó Lugol en muestras inoculadas que contienen almidón. Si el color es amarillo transparente la prueba es positiva, porque el iodo no forma complejos con los enlaces dobles cuando el almidón es desintegrado (Chain, 2011).
e) Oxidasa con KOH
Se colocó una gota de hidróxido de potasio al 3% sobre un portaobjetos, después, con la ayuda del asa de Pasteur, se obtuvo una muestra del cultivo de Rhizobium para ponerla en la gota haciendo movimientos circulares durante tres minutos (Chain, 2011).
Resultados
Cultivo de la bacteria Rhizobium a partir de nódulos de plantas leguminosas: El cultivo se realizó en varias ocasiones al igual que la siembra para finalmente obtener colonias aisladas utilizando el método de strate plate en una incubadora a 24°C, los resultados de la siembra se observaron trascurridas las 42 horas, para su identificación a nivel microbiológico se realizó tinción Gram.
A
nivel morfológico las bacterias cultivadas presentaron coloración
blanquecina, bordes lisos y una estructura plana, en la tinción
Gram se observaron bacilos de color rojo, la tinción Gram se
realizó en diferentes partes del cultivo y se observó que las
bacterias se aglomeraban hacia el centro. 
Coloración
blanquecina
Bordes
lisos
Fig.1 Bacterias aisladas a partir de nódulos de leguminosas al segundo día de su incubación.
Resultados
de Tinción Gram
Bacilos
de coloración rojiza.
Fig.2 Tinción Gram de las bacterias cultivadas.
Exposición de las bacterias cultivadas a diferentes fuentes de carbono.
Las bacterias cultivadas se expusieron a caldos que contenían diferentes fuentes de carbono y se observó su desarrollo mediante el uso del espectrofotómetro y se compararon entre ellas y un blanco. Se obtuvieron niveles superiores en los caldos que contenían glucosa seguida por fructuosa siendo mucho menor la concentración en el caldo que contenía almidón.
Tabla 2.
Valores obtenidos en el espectrofotómetro para la exposición de la bacteria a diferentes fuentes de carbono. Blanco, Almidón, fructuosa, glucosa.
|
|
B |
T1 |
T2 |
T3 |
||||||||
|
1 |
0.012 |
0,019 |
0,020 |
0,023 |
0,067 |
0,026 |
0,074 |
0,063 |
0,054 |
0.033 |
0,064 |
0,065 |
|
5 |
0.022 |
0.021 |
0.020 |
0.027 |
0.082 |
0.032 |
0.085 |
0.080 |
0.083 |
0.066 |
0.092 |
0.095 |
|
6 |
0,016 |
0,021 |
0,019 |
0,017 |
0,016 |
0,021 |
0,049 |
0,021 |
0,025 |
0,043 |
0.021 |
0,026 |
Elaborado por: Los autores
Pruebas bioquímicas realizadas al cultivo para la confirmación de que se trata de Rhizobium
Catalasa
En la prueba catalasa se observó que al realizar la adicción de agua oxigenada las bacterias burbujearon.
Fig.3 Resultado obtenido para la prueba catalasa.
Ureasa
Fig.
4.
Resultados prueba Ureasa
En la prueba de Ureasa se obtuvieron resultados a las 24 horas de haber inoculado muestras bacteriológicas de Rhizobium las cuales reaccionaron con la enzima ureasa mostrando un distintivo color rojizo, resultando positiva.
Rojo-Fenol
Fig.
5
Resultados prueba rojo fenol
En la prueba de rojo fenol se obtuvo un resultado positivo, esto se logró observar al transcurrir 24 horas de haber inoculado muestras bacteriológicas de Rhizobium en el caldo de rojo fenol, las cuales mostraron un cambio de color que pasaron de rojizo-anaranjado a un color totalmente amarillo
Prueba
de Amilasa
Fig. 6 Resultado obtenido para la prueba de amilasa
La prueba de amilasa resulto positiva para el caso de Rizhobium, esta prueba permite investigar la presencia en el microrganismo de la enzima amilasa la cual es capaz de hidrolizar el almidón.
Potasa
Fig.7. Resultado obtenido de la prueba de KOH 0.3%.
En la prueba de obtuvo un resultado positivo, esto se logró después de impregnar unas gotas del reactivo sobre una lámina donde contenía una pequeña parte del microorganismo, en donde, se pudo observar como la muestra de Rhizobium adopta una forma viscosa y pegajosa indicando que dichos microorganismos son gram negativos.
Discusiones
Cultivo de la bacteria Rhizobium a partir de nódulos de plantas leguminosas
Realizar los cultivos como la siembra en varias ocasiones permitió obtener de forma óptima las bacterias requeridas, es decir, en un principio los primeros cultivos presentaron partes en las que se observaba claramente que hubo contaminantes, tales como hongos, pero a medida que se realizaban los cultivos se obtenían mejores resultados, en este ocasión se pudo determinar que dichas bacterias eran del género Rhizobium ya que presentaron coloración blanquecina, bordes lisos, consistencia mucosa gracias a los lipopolisacáridos y una figura elevada y plana.
Tinción Gram
En la tinción Gram, se observaron bacilos que se pintaron de color rojo, la realización de tinción Gram se realizó en diferentes partes del cultivo y se observó que las bacterias se aglomeraban hacia el centro. Las bacterias Rhizobium son bacilos móviles, aerobios, alargados Gram-negativos, con dos capas de pared celular, la primera capa está constituida por carbohidratos y proteínas y la segunda capa está formada por lípidos y carbohidratos.
Exposición de las bacterias cultivadas a diferentes fuentes de carbono.
Debido al crecimiento alto en el medio glucosídico, se encontró que baterías Rhizobium tienen una alta tolerancia al consumo de glucosa esto gracias a que son quimio-organográficas, utilizando una gran variedad de carbohidratos y ácidos orgánicos para su nutrición. Por ende, su crecimiento tiene un buen rendimiento al momento de ser inoculadas en medio de glucosa ya que les resulta más fácil obtener fuente directa de glucosa y no descomponerla del almidón.
Prueba de Catalasa
Al realizar la prueba de la catalasa se pudo observar la presencia de burbujas en la muestra de las bacterias, esta reacción se da gracias a la enzima catalasa que es producida por la misma bacteria. Esta enzima reacciona casi de inmediato al peróxido de hidrógeno produciendo una hidrólisis, la cual provoca que se libere agua y oxigeno de forma instantánea.
Prueba de Ureasa
A las 24 horas de haber realizado la prueba de la ureasa se pudo observar que el cultivo contenido de la enzima ureasa conjuntamente con las muestras bacteriológicas mostraron un color rojizo, esto se produce gracias a que la enzima ureasa hidroliza la urea contenida en las muestras bacterianas dando como resultado el desprendimiento de amoniaco y dióxido de carbono, con este resultado se afirma la presencia de Rhizobium ya que esta contiene nitrógeno en su estructura (Cristhop, 2005).
Prueba de Carbohidratos con rojo fenol
Decido a la fermentación y metabolismo de carbohidratos la prueba de rojo fenol resulto positiva, ya que estos producen ácidos medianamente fuertes, esto va a depender netamente del tipo de carbohidrato que se ubique en el caldo. El rango del indicador de pH del rojo fenol va desde 6.8 a 8.4, es decir, si se forma un ácido este tomará un pH ácido el cual provocará el cambio de color de rojo a amarillo, en cambio si dicha reacción sale negativa este se mantendrá con el mismo rango de pH el cual provocará que se mantenga el mismo color rojizo- anaranjado.
Prueba de Amilasa
El género Rizhobium es un microorganismo perteneciente a los Bacilos que se caracterizan por ser degradadores de carbohidratos, en un principio se le denomino Bacilo radicícola. Básicamente lo que sucede en esta prueba es que, se añade carbohidratos en este caso el almidón y después con ayuda de un indicador como el lugol se puede determinar la presencia de subproductos hidrolizados .El almidón contiene amilosa y amilopectina la adición de lugol reacciona con amilasa generando un compuesto azul, como la bacteria consumió este. Compuesto se esperaba una reacción amarilla ya que el iodo no forma dobles enlaces con el almidón desintegrado.
Prueba de la potasa (KOH 0.3%)
La prueba de la potasa a su vez también conocida como test de la cuerda consiste en la degradación de las paredes de las bacterias por medio del reactivo KOH. Se sabe que las paredes de las bacterias gram negativas está formada por peptidoglicano en una proporción menor a las positivas, por lo que resulta más fácil de disolver y de esta manera el contenido interior de la célula bacteriana se libera formando una especie de cuerda al momento de hacer contacto con cualquier objeto sobre la muestra.
Conclusión
Las bacterias del genero Rhizobium, son organismos que se encuentran presentes en los nódulos de algunas plantas entre ellas el maní forrajero comúnmente conocido como maní silvestre. Mediante el análisis estadístico ejecutado se puede concluir que el género Rhizobium presenta una mayor crecimiento en medios con glucosa esto es debido a que al ser monómeros las bacterias son capaces de tomarlas del medio adecuadamente a pesar que si se observó crecimiento no fue el esperado ya que estos carbohidratos no son los que la bacteria consume normalmente, sin embargo si los puede emplear porque son bacterias quimio-organográficas. Las pruebas bioquímicas permiten determinar la existencia de diferentes enzimas en las bacterias y es una herramienta para la clasificación de las mismas, en este caso la prueba de KOH 3% indicó que en efecto las bacterias analizadas pertenecían al género Rhizobium.
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